高通量IgG定量平台——用于药物发现和开发过程中克隆筛选

 

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在单克隆抗体开发和生产的许多阶段,测定 IgG 的产生是关键步骤。常用的 IgG 定量测定方法要么需要特殊仪器和娴熟人员,例如高效液相色谱法 (HPLC) 和表面干扰量度法,要么需要耗时的测定法,例如酶联免疫吸附检测 (ELISA)尽管 ELISA 是一种被广泛认可的蛋白定量方法,但它操作过程时间长,步骤多。Valitacell公司 的 Valita®TITER通过荧光偏振(FP)检测可在细胞系开发工作流程中精确快速定量IgG

 

Valita® TITER实验原理

基于荧光偏振(FP)技术Valita®TITER 实验可以用来检测 IgG Fc 与蛋白G的相互作用。96 孔微量滴定板的每个孔都涂有荧光标记的 IgG 结合肽蛋白G。向孔中添加样本时,蛋白G分子重悬并与之发生结合。蛋白G结合抗体时,其分子运动的速度下降,从而导致荧光偏振值升高

 

Valita® TITER实验流程

 

如上图所示,Valita®TITER整个实验流程无需对样本做任何处理,无需额外添加任何试剂,更没有洗板等复杂操作步骤,仅需不到15分钟就能完成96个样的IgG定量,非常的简单高效!

 

ValitaCell提供了一个全面优化的快速、稳健和准确的IgG检测平台,本文我们以Valita®TITER IgG定量试剂盒与Molecular Devices酶标仪结合使用为例

 

实验材料

  Valitacell Valita®TITER Kit (cat. #VAL003)

  Valitacell Valita®TITER Plus Kit (cat. #VAL004)

 

  Sigma IgG standard (Sigma cat. #I2511)

 

   XP Media™ CHO Growth A (Molecular Devices cat.

#K8860), supplemented with 4 mM L-glutamine

 

  SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader

  SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader

  SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader

  SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader

 

实验方法

  1. 使用XP Media™ CHO Growth A作为稀释液,对IgG标准品进行一系列稀释,稀释浓度从2.5-100mg/L (Valita®TITER Kit)或100-2000mg/L (Valita®TITER Plus Kit)。
  2. 向微孔板中加入60μL培养基。
  3. 加入60μL标准品或样品到相应的孔中,吸打3次混匀(实验过程可参考下图)。
  4. 微孔板常温避光孵育5分钟(Valita®TITER Kit)或15分钟(Valita®TITER Plus Kit),用Molecular Devices酶标仪读取数据,酶标仪参数设置参考下表。



适用于 Valita®TITER Kit 酶标仪参数设置表

 

适用于 Valita®TITER Plus Kit 酶标仪参数设置表

 

实验结果

研究人员开展的这项工作,主要是为了确定Valita®TITERMolecular Devices多种型号酶标仪上使用时的最佳参数,以便为高通量药物发现和开发提供一个高性价比高通量IgG测定平台。只需通过简单的加入-读板方法制备IgG标准曲线,没有样品前处理、微孔板预处理、洗板等步骤,实验流程简单易操作。

如SpectraMax iD5酶标仪使用485 nm激发光和535 nm发射光可获得优异的实验结果。IgG标准品浓度从2.5mg/L到100mg/L(Valita®TITER)或从100mg/L到2000mg/L (Valita®TITER Plus)在整个范围内具有很好的线性(R2 = 0.99)(如下图)。Valita®TITER Kit Valita®TITER Plus Kit在SpectraMax i3xParadigm和 M5平台的实验数据见下表。SoftMax®Pro软件中的预设置功能可自动进行mP计算和曲线绘制。

Valita®TITER Kit(R2=0.993)标准曲线

 

Valita®TITER Plus Kit(R2=0.998)标准曲线

 

 

Valita®TITER Kit在Molecular Devices各平台实验数据

Valita®TITER Plus KitMolecular Devices各平台实验数据

 

 

 

结论

准确、可靠地测量IgG浓度以确保生物制剂生产时最佳细胞培养性能,药物开发和后续生产至关重要。一种能够以最少的时间和资源投入获得准确结果的分析方法是成功的关键。在这里,我们成功地证明了结合Molecular Devices酶标仪和Valita®TITER测定方法能够全面的准确定量IgG浓度。

Valita®TITER分析是一种均相的、高通量的方法,精确和快速定量IgG浓度,不需要样品制备或纯化步骤。该96孔检测方法已在SpectraMax iD5酶标仪和其他具有FP检测的Molecular Devices酶标仪上充分验证,以确保结果可靠SoftMax Pro软件能自动进行标准曲线拟合和样本定量,减少检测的设置时间。

 

Valita®TITER适用仪器平台

Valita®TITER兼容市面上常见的多种荧光偏振酶标仪,并且由于Valita®TITER的实验流程非常简单,该方法不光局限于人工手动操作,还能整合入各种半自动、全自动生产线中,从而实现真正的高通量检测。

Valita®TITER兼容多种市面常见品牌的读板仪

 

Valita®TITER能整合各种自动化生产线

 

 

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