【技术在线】HCP ELISA方法验证——加标回收（Spike & Recovery）-北京西美杰科技有限公司

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【技术在线】HCP ELISA方法验证——加标回收（Spike & Recovery）

前言

在ELISA试剂盒的使用过程中，确保结果的准确性至关重要。为了有效识别样品配方与试剂盒组分之间的兼容性，加标回收这一关键验证试验显得尤为重要。它不仅是评估ELISA试剂盒准确性的重要工具，也是满足法规和药典（如ICH或FDA指南等）对商品化ELISA试剂盒方法学验证要求的可靠方式。

什么是加标回收？

加标回收就是将已知量的标准品添加到样品中（“加标”，spiking），通过对比加入前后的检测结果，评估“回收”（recovery）测量值的准确性。这一过程可以揭示样品及其缓冲液中某些成分是否会干扰检测结果。目前，影响ELISA试剂盒定量结果的常见因素包括极端pH、去污剂、有机溶剂、高蛋白质浓度以及高盐浓度等。因此，在进行加标回收实验之前，确保排除这些干扰因素是至关重要的。

如何判定干扰因素？

样品或缓冲液中的某些成分可能会影响HCP或其他杂质的检测与定量，导致回收结果的高估或低估，由此说明样品中存在干扰因素。同样，上游收获物和过程样品的基质中也可能存在疑似干扰 ELISA 检测的成分。

在有干扰的情况下，实验结果通常表现为回收率偏低。但是，如果药物本身或其他基质组分与捕获或检测抗体有相互作用，则可能表现为回收率偏高。

此外，非特异性干扰，如试剂与孔板的结合，也会导致OD值偏高。通过合理控制实验流程，可以找出具体的干扰因素。

何时进行加标回收实验？

在进行加标回收实验前，需要先完成样品的稀释线性分析，只有明确了最低需求稀释倍数（MRD），加标回收分析才有意义。（稀释线性分析的详细内容请参考《HCP ELISA方法验证——稀释线性dilution linearity》）

（Tips：每种类型的样品基质都需要进行加标回收分析。同时如果实验步骤进行了优化，则需要重复此实验以确保检测的有效性。）

如何执行加标回收分析？

样品制备：

加标样品：可以设定3-4个不同浓度的标准品加入到不同类型待检样品中，制备成加标样品，需要注意的是加标样品的浓度需在满足MRD的条件下进行分析，也就是最低加标浓度不能低于LOQ的两倍。
对照样品：按相同体积比在每种待检样品中加入样品稀释液，制备成对照样品，用于测定样品本底的HCP浓度。

实验过程：

使用ELISA试剂盒同时检测加标样品和对照样品，每个样品最好做3个重复孔，以计算均值。

结果分析：

回收率计算公式：

如下表案例所示，我们使用大肠杆菌HCP ELISA试剂盒（F410）分别检测加标样品（100 ng/mL标准品与样品按1:4体积比混合，加标浓度为20 ng/mL）和对照样品（样品稀释液与样品按1:4体积比混合），通过测得的HCP浓度计算出回收率为95%。

依据ICH、FDA及EMA等分析方法验证指南要求，HCP加标回收率的可接受范围应在75%~125%。

为了方便您快速了解如何用4倍稀释法制备加标样品和ELISA布板的详细步骤，请观看以下操作视频。

加标回收问题排查

如果加标回收数据显示出明显的产物或基质干扰，您可能需要通过进一步稀释样品或置换缓冲液等方式来获取准确的检测结果。理想情况下，请选择与标准品相同的稀释液进行样品稀释，这样可以最大限度地减少偏差。在某些情况下，调整检测方法也许能提高特定样品类型的准确性，但请务必谨慎操作，以免影响结果的可靠性。

为了全力支持客户进行加标回收验证及方法学开发，Cygnus为每款ELISA试剂盒都配备了相应的标准品，详情请查阅下表。

货号	品名	规格	适用的试剂盒货号
F553H-1	CHO HCP Antigen Concentrate, 3G	400 µl	F550-1
F1048X	CHO Lysate HCP Antigen Concentrate	200 uL	F1045
F1023X	E. coli HCP 2G Antigen Concentrate	200 uL	F1020
F1063X	BL21(DE3) HCP Antigen Concentrate	200 µl	F1060
F653SX	HEK 293 Antigen Concentrate	250 µl	F650S
F1043X	Sf9 HCP 3G Antigen Concentrate	200 µl	F1040
F1018X	P. pastoris HCP Antigen Concentrate	200 µl	F1015
F143U	P. pastoris Antigen Concentrate	200 µl	F140/F640
F978X	Vero Cell 2G HCP Antigen Concentrate	400 µl	F975
F1058X	PER.C6 HCP 2G Antigen Concentrate	200 µl	F1055
F1033X	SP2/0 HCP 2G Antigen Concentrate	200 uL	F1030
F998X	PG13 HCP Antigen Concentrate	200 uL	F995
F493G	L. lactis HCP Antigen Concentrate	200 µl	F490
F233G	A549 Antigen Concentrate	200 µl	F230
F813X	HeLa Antigen Concentrate	1 ml	F810
F803X	MDCK Antigen Concentrate	1 ml	F800
F513G	BHK HCP Antigen Concentrate	1 ml	F510
F227C	NS/0 Antigen Concentrate	1 ml	F220
F453X	P. fluorescens Antigen Concentrate	1 ml	F450
F823X	CAP® Antigen Concentrate	400 µl	F820
F1028X	C1 HCP Antigen Concentrate	200 uL	F1025
F603X	Protein A Antigen Concentrate	250 µl	F600
F613X	Protein A Antigen Concentrate	250 µl	F610
F403H	Protein A Antigen Concentrate	200 µl	F400
F044	Protein A Concentrate	200 µl	F050/F050H
F740-C	Amsphere™ A3 Ligand Protein A Control	250 µl	F740
F968X	Avantor J.T.Baker® BAKERBOND® PROchievA™ Protein A Antigen Concentrate	250 µl	F965
F743X	Amsphere™ A3 Ligand Protein A Antigen Concentrate	300 µl	F740
F1068X	Protein L Antigen Concentrate	200 µl	F1065
F963X	EndonucleaseGTP® Antigen Concentrate	500 µl	F960
F031G	BSA Antigen Concentrate	1 ml	F030

虽然加标回收可以验证HCP ELISA的准确性，但这只是整体方法学验证的一部分。完整的验证过程仍需包括精密度、LOD、LLOQ、ULOQ和HCP抗体覆盖率等分析。Cygnus针对每一种检测试剂盒均提供相应的QS（Qualification Summary）文件，如有需求欢迎点击这里填写信息索取，或直接联系Cygnus中国总代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA试剂盒的过程中遇到任何问题，我们的技术支持团队将竭诚为您提供解决方案和建议。

Cygnus Technologies专注为生物技术和生物制药行业提供产品和分析方法超过25年，旨在加速研发阶段和提高产品质量。Cygnus开发和生产的生物工艺残留试剂盒，用于检测超过50种不同表达系统的特异性杂质。Cygnus作为专注于生物技术应用免疫检测的高灵敏度分析技术的专家，其产品和服务已经被全球超过95%以上生物制药公司使用，并获得FDA、NMPA、EMA等监管机构的广泛认可。

北京西美杰科技有限公司作为Cygnus在中国总代理，与国内众多知名药企，CRO/CMO企业建立了长久稳定的合作关系。多年来西美杰的产品及服务帮助许多企业加速R&D阶段，提高药物质量、纯度和安全，加速优化研发工艺，减少产品上市时间，降低QC成本。如您对上述产品感兴趣，欢迎致电西美杰客服热线400-050-4006或者登陆网站www.xmjsci.com了解更多信息。