HCP ELISA实验布板优化指南：提升数据准确性的关键-北京西美杰科技有限公司

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HCP ELISA实验布板优化指南：提升数据准确性的关键

截至目前，ELISA方法仍是工艺监测和产品批次放行中检测并定量HCP的金标准。Cygnus提供HCP 检测试剂盒已经超过25年，开发了许多专利方法生产对HCP具有广泛反应性的抗体，目前提供超过32种不同的表达平台的HCP ELISA检测试剂盒。

Cygnus的ELISA试剂盒使用预包被板，检测同时加入抗原与检测抗体进行孵育。HCP检测实际上相当复杂，主要依赖于能够对数千种HCP产生反应的HCP抗体，要使 ELISA检测的结果准确，针对抗原的捕获和检测抗体必须都要过量。只有在抗体过量的条件下，才能得到正斜率的剂量曲线，从而实现准确的定量。因此，合理的孔板布局设置是一个很好的开始。

Cygnus HCP ELISA检测基本流程

一、HCP ELISA布板规范

1. 复孔要求

推荐采用三复孔设计，三个复孔是最有效的做法，可以发现并去除可能出现的异常值，在完成实验后做问题排查时能提供更多信息。需要注意的是，如果检测样品数量不支持设置三复孔，那么最少要设置双复孔，没有复孔的检测是无效的。如果可以的话，最好对标准品和对照品设置三复孔。

2. 空白对照

不建议设置额外的空白对照，扣除空白对照不会改善实验结果，甚至还会导致CV值升高。详情请参考《使用Cygnus ELISA试剂盒该如何设置空白对照？》。

3. 设置阳性对照。

使用处于标准曲线中间浓度范围的标准品作为阳性对照（低浓度标准品受灵敏度影响较大）。当使用来自HCP标准品的阳性对照时，曲线中间的浓度点通常会提供最多的信息。

4. 设置阴性对照

使用样品稀释液作为空白对照，从而评估0浓度标准品与所使用的稀释液之间是否存在显著偏差。

5. 设置1-2个额外的HCP对照

可以使用工艺流程中的一个已经过充分表征的在制品样品作为额外的HCP对照。有富余孔的条件下，设置两个稀释度会比只有一个稀释度效果更好。

6. 使用低结合板优化加样步骤

在向孔板加样时，最重要的是要思考完成每一步骤需要多长时间，每一步骤的移动方向是什么。对于这种情况，预先将待检样品和酶标二抗加入低结合板内，然后再整个转移到检测孔板中，这样能够大幅减少将样品添加到检测板时造成的加样误差。

二、ELISA布板示例

样品布板的最佳方式是将标准品置于板的左侧，将对照品（阴性或阳性对照）置于板的右侧，同时还要考虑需要设置的复孔数量，样品稀释梯度，以及在加样和洗板时的移动方向。将标准品和质控品分别置于板的两侧，确保可以从孔板的任意一侧都能获取相同的信息。这样能够清晰地反映出在加样时或洗板过程中可能出现的任何操作失误，而且通过改变这些孔在板内的位置能够更好地进行问题排查。

三复孔布板推荐示意图

5个样品4个稀释梯度，所有标准品、样品及对照品都设置三个复孔

双复孔布板推荐示意图

4个样品和加标控制品都设置4稀释梯度，所有标准品、样品及对照品都设置双复孔

未知浓度HCP样品布板推荐示意图

4个样品8个稀释梯度，以便收集未知HCP水平样品的大部分信息。

更多布板示例文末获取。

三、HCP ELISA布板常见问题排查及解决办法

1. 加样问题

在HCP ELISA检测过程中，每2分钟的静态孵育相当于1分钟的震荡孵育。也就是说，如果加样耗费了20分钟，就相当于最先加入的样品比最后加入的样品多孵育了10分钟。假如震荡孵育的时间为1个小时，而加样就花费了20分钟，那么势必会导致前后加入的样品结合效率有差异，结果表现为最先加入的样品会得到偏高的OD值。因此，加样的原则是要确保板内所有孔的孵育时间尽可能一致。如果一次需要检测的样品数量较多，为了避免在加样过程耗费太多时间，我们建议先将样品和酶标抗体加入低结合板中，然后再用排枪快速转移到检测板内。实践证明，这种操作方法可以有效改善因加样时间差而导致的结果异常问题。

2. 洗板问题

不合理的洗板操作也会导致检测结果的异常，与加样操作类似，HCP ELISA洗板需要遵循的核心原则就是交替方向洗板，也就是尽可能确保所有孔的总清洗时间一致。关于洗板操作的注意事项请参考《如何用正确的洗板方法解决ELISA检测结果漂移的问题？》

四常见错误案例与改进办法

案例一加样缓慢造成的误差

如果同一个样品依次从A到H行，按照1到12列方向逐孔缓慢加样，即使采用了正确的洗板方式，这种加样方式也会对检测结果产生影响。以下热图示例展示了如果将相同的样品以缓慢的速度加入孔板会发生的情况。

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	1.000	0.976	0.952	0.928	0.904	0.880	0.856	0.832	0.808	0.784	0.760	0.736
B	0.997	0.973	0.949	0.925	0.901	0.877	0.853	0.829	0.805	0.781	0.757	0.733
C	0.994	0.970	0.946	0.922	0.898	0.874	0.850	0.826	0.802	0.778	0.754	0.730
D	0.991	0.967	0.943	0.919	0.895	0.871	0.847	0.823	0.799	0.775	0.751	0.727
E	0.988	0.964	0.940	0.916	0.892	0.868	0.844	0.820	0.796	0.772	0.748	0.724
F	0.985	0.961	0.937	0.913	0.889	0.865	0.841	0.817	0.793	0.769	0.745	0.721
G	0.982	0.958	0.934	0.910	0.886	0.862	0.838	0.814	0.790	0.766	0.742	0.718
H	0.979	0.955	0.931	0.907	0.883	0.859	0.835	0.811	0.787	0.763	0.739	0.715

改进办法：预先在低结合板中加入酶标抗体和样品，之后再用排枪将所有样品快速转移到检测板中进行孵育。这样可以有效减少不同孔加样的时间差，确保所有孔的孵育时间尽可能一致，进而降低异常值出现的概率。

案例二同一个方向洗板造成的误差

如果4次洗板都是同一个方向加入洗液的话，也会对检测结果造成影响。以下热图示例展示了4次洗板都是用排枪按照1到12列加入洗液可能发生的情况。

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.670	0.700	0.730	0.760	0.790	0.820	0.850	0.880	0.910	0.940	0.970	1.000
B	0.670	0.700	0.730	0.760	0.790	0.820	0.850	0.880	0.910	0.940	0.970	1.000
C	0.670	0.700	0.730	0.760	0.790	0.820	0.850	0.880	0.910	0.940	0.970	1.000
D	0.670	0.700	0.730	0.760	0.790	0.820	0.850	0.880	0.910	0.940	0.970	1.000
E	0.670	0.700	0.730	0.760	0.790	0.820	0.850	0.880	0.910	0.940	0.970	1.000
F	0.670	0.700	0.730	0.760	0.790	0.820	0.850	0.880	0.910	0.940	0.970	1.000
G	0.670	0.700	0.730	0.760	0.790	0.820	0.850	0.880	0.910	0.940	0.970	1.000
H	0.670	0.700	0.730	0.760	0.790	0.820	0.850	0.880	0.910	0.940	0.970	1.000

改进办法：建议采用交替方向的方式洗板，也就是第1和3次洗板与第2和4次洗板要从相反的方向加入洗液。

五 HCP ELISA结果异常案例与问题排查

如下图所示，该检测结果样品复孔之间出现自左向右的降低的趋势，且孔板右侧的阴性对照和阳性对照的OD值都比左侧低。通过两侧阳性对照结果不一致可以判定此次实验是失败的。此外，左侧阴性对照复孔之间OD值的平均差异为0.01，而右侧阴性对照的OD值则接近背景水平，因此还需更多信息来进一步判断问题来自加样还是洗板。

综上所述，本次实验失败的原因可能为：1、加样太慢；2、洗板没有交替方向的操作。

STD 1

Sample 1 Dilution 1

Sample 3 Dilution 1

Sample 5 Dilution 1

STD 2

Sample 1 Dilution 2

Sample 3 Dilution 2

Sample 5 Dilution 2

STD 3

Sample 1 Dilution 3

Sample 3 Dilution 3

Sample 5 Dilution 3

STD 4

Sample 1 Dilution 4

Sample 3 Dilution 4

Sample 5 Dilution 4

STD 5

Sample 2 Dilution 1

Sample 4 Dilution 1

Negative Control (Diluent)

STD 6

Sample 2 Dilution 2

Sample 4 Dilution 2

Control Dilution 1(External HCP)

STD 7

Sample 2 Dilution 3

Sample 4 Dilution 3

Control Dilution 2 (External HCP)

STD 8

Sample 2 Dilution 4

Sample 4 Dilution 4

Postive Control (STD 5 repeat)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	2.500	2.450	2.400	1.200	1.150	1.100	2.000	1.950	1.900	1.700	1.650	1.600
B	1.200	1.150	1.100	0.600	0.550	0.500	1.000	0.950	0.900	0.850	0.800	0.750
C	0.600	0.550	0.500	0.300	0.280	0.260	0.500	0.480	0.460	0.425	0.405	0.385
D	0.300	0.250	0.200	0.150	0.140	0.130	0.250	0.240	0.230	0.212	0.202	0.192
E	0.150	0.130	0.110	1.400	1.350	1.300	0.125	0.115	0.105	0.005	0.005	0.005
F	0.075	0.065	0.055	0.700	0.650	0.600	0.550	0.500	0.450	0.230	0.225	0.220
G	0.038	0.033	0.028	0.350	0.330	0.310	0.290	0.270	0.250	0.115	0.095	0.075
H	0.015	0.010	0.005	0.175	0.165	0.155	0.145	0.135	0.125	0.090	0.080	0.070

总结

 在ELISA实验之前应该合理规划孔板布局：优化的孔板布局能够监测关键性能指标，并在出现问题时更快地进行问题排查。更多布板示例请点击这里获取。

 HCP ELISA的关键考虑因素包括：复孔设置、样品稀释梯度、加样和洗板的操作、对照的设置。

 用低结合板来优化加样操作，可以最大程度减少OD值的偏差。

 切勿使用空白对照，这样做会提高检测结果的变异系数。